23日上午

9:00-12:00

基因修饰技术简介

l  基因打靶与基因编辑技术（ZNF, TALENs，CRISPR/Cas9）介绍

l  CRISPR/Cas9 结构和特点

l  如何使用 CRISPR/Cas9 系统对特定基因进行敲除或定点插入（详细方法步骤）

l  新基因编辑工具 Cpf1 的结构、特点、工作原理（基因编辑工具知识拓展）

l  如何使用 Cpf1 系统对特定基因进行敲除或定点插入

l  Cpf1 与 CRISPR/Cas9 的异同

l  Cpf1 的应用和技术展望

l  CRISPR/Cas9 系统介绍的相关值得推荐的视频

CRISPR（sgRNA）设计方法和相关网站介绍

l  sgRNA 设计方法和相关网站介绍

实验一：CRISPR（sgRNA）的在线设计（请自带可无线上网之笔记本电脑或手机）（在线互动设计演练）

l  sgRNA 设计后挑选 sgRNA 经验和心得分享

23日下午

13:00-18:00

实验二：

gRNA oligos 模板退火

退火 gRNA 与线性化 CRISPR/Cas9 载体连接，

连接产物转化到大肠杆菌（DH5α）

转化产物涂板培养

基因编辑质粒 ps330A 和 ps330S 系列如何具体构建和使用

CRISPR/Cas9作为基因编辑工具的实验用处、案例

l  Cas9 的多功能系统（如 Cut, Nick, Activate, dCas9-FokI）的详细介绍。

l  利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰小鼠方法与相关基因修饰小鼠模型

l  利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大动物（猪、猴）方法与相关基因修饰大动物模型介绍

24日上午

9:00-12:00

利用 CRISPR/Cas9 技术编辑动物细胞系

l  CRISPR/Cas9 质粒细胞转染方法

l  阳性细胞克隆筛选

l  基因编辑细胞系的建立

l  基因修饰情况分析方法

实验三：

gRNA oligos 模板退火CRISPR/Cas9 重组子细菌克隆挑取，扩大化培养，鉴定；

基因修饰基因组 DNA 模板（转染 CRISPR/Cas9 到动物细胞后提取 DNA）制备；

目的靶基因的基因组 DNA 片段的 PCR 扩增，电泳检测 PCR 产物；

PCR 产物退火变性，T7E1 酶切，电泳鉴定基因修饰情况；

利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因敲除或敲入小鼠

l  基因编辑工具 CRISPR/Cas9 基本背景介绍

l  sgRNA 设计及其功能验证

l  小鼠受精卵分离和培养

l  CRISPR/Cas9 系统显微注射到小鼠受精卵

l  受精卵显微注射后回输到代孕母鼠体内

l  PCR 和 T7E1 分析和鉴定基因敲除小鼠（Founder）

l  基因敲除小鼠基因敲除情况分析

l  CRISPR/Cas9 构建基因敲除小鼠详细实验流程归纳和总结

24日下午

13:00-17:00

实验：实验结果的点评与讨论

CRISPR/Cas9 载体构建讨论；

目的靶基因的基因组 DNA 片段的 PCR 扩增，电泳检测 PCR 产物结果讨论；

PCR 产物 T7E1 酶切，电泳鉴定基因修饰情况结果讨论；

Sanger 测序鉴定基因编辑结果；

利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因修饰大型动物（猪）

l 利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大型动物（猪）流程

l  基因修饰大型动物优势

l  利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大动物（猪）模型介绍

CRISPR/Cas9 脱靶问题分析

l  脱靶产生的原因

l  脱靶检测方法

l  降低脱靶问题的方法

CRISPR/Cas9 技术的发展、应用、拓展及伦理问题

l  新基因编辑工具 Cpf1，C2C2 的用法与比较

l  基因编辑工具的伦理问题

l  基因编辑工具的应用拓展

l  根据学员的研究内容，详细答疑如何使用基因编辑工具